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文库是一种强大的工具，用于遗传筛选，或鉴别未知的基因。文库可以通过多种不同质粒制备。在给定的文库中，质粒具有相同的主干，但它们表达或靶向不同的基因。一些文库覆盖了大部分基因组，而另一些则局限于某些基因。在cDNA文库中，每个质粒都有一个独特的cDNA。在shRNA或gRNA文库中，每个质粒都包含一个独特的基因靶向序列，但整个文库中每个基因都有多个靶向序列。编码文库包含具有独特的semi-random序列的质粒，这些质粒可用于血统追踪或解析一次表达多个基因的效果等应用。

Addgene提供的文库是在一个试管中混合多种质粒。如果文库被设计成只覆盖一小部分基因，那么文库就会很小；但它也可以很大(例如Moffat实验室的Toronto KnockOut (TKO)文库有超过175,000个包含不同gRNA的质粒)。

一、gRNA文库

gRNA文库是通过一段与目标DNA相同的gRNA指导Cas9核酸酶对靶基因进行DNA修饰，以此造成基因功能突变或缺失。gRNA文库是药物筛选或靶向筛选特定通路的理想工具，在功能基因筛选、疾病机制研究及药物研发等方面发挥重要的功能。

二、文库的使用

一旦您从Addgene收到文库后，请查看文库信息，看看它是否应该先扩增，然后再进行筛选。如果您需要先扩增文库，请参考寄存人提供的方法，以获得最佳效果。

对于某些文库，质粒DNA可以直接递送到细胞内。而其他的，特别是集合慢病毒质粒的文库，必须先用于制造病毒。随后，用这种混合病毒将质粒运送到靶细胞。无论什么情况，都建议对大规模制备的 DNA进行二代测序，以验证文库的完整性。不完整的文库可能导致在以后的实验中出现假阳性或假阴性，并可能对数据的重现性产生负面影响。

三、文库筛选分类

在文库筛选中，细胞以极低的MOI感染，确保每个细胞最多进入一种质粒。为了确保每个质粒在群体中都得到充分的表达，您需要感染比文库中质粒数量多得多的细胞。例如，Moffat实验室使用了高于TKO文库中质粒数量200倍的细胞。使用大量的细胞将可能导致假阳性或阴性结果的影响最小化。

上图概述了gRNA库是如何使用的。以下是筛选过程中应采取的一般步骤：

1. 扩增文库(电穿孔法和大规模制备法)。

例：#gRNA文库# 构建的载体数量较少，不足以进行文库的慢病毒包装和使用。因此，需要对载体进行扩增。将gRNA载体构建完成后，乐动（中国）将这些载体按相同的比例混合成一个pool（即载体混合库），随后将载体混合库使用专用电转感受态，电转扩增培养并收集菌落，并进行扩大培养，最后抽提质粒，即得到了扩增后的载体混合库，也就是文库。

2. 如果通过病毒传递，则先制造病毒；这就创建了一个慢病毒CRISPR文库。

例：扩增后的gRNA文库在慢病毒包装载体的辅助下转染293T细胞，进行慢病毒的包装。由于gRNA文库是由多个不同的gRNA载体混合而成，因此获得的慢病毒是混合型病毒库，每个病毒携带单个gRNA载体。

3. 将文库递送到靶细胞。

文库筛选可分为两类：正筛和负筛。

正筛：

• 应用文库

• 应用筛选（多数细胞死亡或未通过筛选（通过报告基因））

• 挑出通过筛选的细胞

• 细胞测序

• 得到通过筛选的基因列表

在正向筛选中，目标是识别那些选择后存活下来的细胞。选择压力必须足够强，使大多数细胞死亡，将它们的质粒从集合中移除，只有一小部分细胞存活下来。收集存活的细胞后，对其质粒进行PCR扩增并使用NGS测序，以鉴定其cDNA或目的基因。正向筛选通常是非常强大的，最初出现的数万个基因可能会缩小到几百个或更少。

负筛：

• 应用文库

• 对对照样本进行二代测序（无选择性），平行应用文库

• 应用筛选（多数细胞存活）

• 对比实验组和对照组的测序结果

• 得到一个通过筛选而消失的gRNA列表

负筛比正筛要复杂一些。在负向筛选中，目标是识别出那些无法通过选择机制存活下来的细胞。您将感染两组细胞，其中一组进行选择，另一组作为非选择的对照。然后使用NGS对这两个群体进行测序，以确定哪些质粒已被选择删除。在CRISPR筛查中，负向筛选通常用于识别在特定条件下对生长/生存至关重要的基因。

二代测序

二代测序技术允许在一次反应中同时对数百万个DNA片段进行平行测序。如上所述，使用这种技术对于执行文库筛选是至关重要的。

参考资料：

如需了解相关信息，可查看网址：http://www.addgene.org/guides/pooled-libraries/

• CRISPR指南，了解更多关于CRISPR/Cas9全基因组筛选的信息。

• 浏览病毒载体资源。

• 查看一些最受欢迎的文库信息。

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以上部分内容来源于Addgene和网络